上海安亭科學儀器廠在本文中介紹離心機在五苓散同方湯劑缺失化學成分藥效的研究中的應用，文中先從本次實驗所需要的實驗材料儀器出發(fā)，并簡單介紹下實驗方法，闡明五苓方小劑量散劑臨床療效遠強于其大劑量湯劑即五苓方宜散不宜湯的物質基礎，對五苓方臨床應用的劑型選擇提供實驗依據(jù)。
1、實驗材料
實驗動物：大鼠，SPF 級，體重 180 ~ 200 g，雄性，56 只，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號 ：SCXK（遼）2015-0001，合格證編號 ：211002300010439，標準飼養(yǎng)條件，溫度：28 ~ 30 ℃ ,相對濕度 ：（55±5）%，光照 ：12 h /d。
2、所需要儀器設備
23- 乙酰澤瀉醇 B（111846-201203）、香豆素（111739-200501）、 麥 角 甾 醇（111846-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院 ；氫氯噻嗪（簡稱HCT， CAS 號 ：58-93-5，SIGMA-ALDRICH），AQP1（PB0498）、AQP2 （BA0649）、AQP4 （PB0500） 抗體及羊抗兔抗體（KGAA35）均購自博士德生物技術有限公司 ；全蛋白提取試劑盒（中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP250）；SDP-PAGE 凝膠電泳試劑盒（中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公 司 KGP113），Western Blotting 檢 測 試 劑 盒（ 中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP1201）；ECL 檢測試劑盒（中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限 公 司 KGP1123）；Trizol（ 美 國 Invirrogen 15596-026）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國 Thermo FisherK1622）等。Real time PCR Master Mix （日本 TOYOBO）；高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠TGL-20bR）；酶標儀（美國BioTek EL-x800）；熒光定量 PCR 循環(huán)儀（美國 ABIStep one plus Real time-PCR system）；分析天平（德國 Sartorius BL310/BL21S）等。
3、實驗方法
將篩選合格的48只大鼠，分為6組，每組8只。正常大鼠的鹽水負荷模型參考文獻方法，并相應改進。正常組 ：無處理，自由飲水 ；模型組 ：灌胃1 % 的鹽水 2.5 ml ；麥角甾醇組（35 mg/kg）：灌胃與含有麥角甾醇的等量鹽水 ；香豆素組（50 mg/kg）：灌胃與含有香豆素的等量鹽水 ；23- 乙酰澤瀉醇B組（50mg/kg）：灌胃與含有23- 乙酰澤瀉醇 B 的等量鹽水 ；氫氯噻嗪組（10mg/kg）：灌胃與含有氫氯噻嗪的等量鹽水。每只代謝籠放 1 只大鼠，給藥體積為 25 ml/kg， 1 次 /d，連續(xù)灌胃給藥 8 d，給藥第 1 天及第 7 天將大鼠置于代謝籠內收集給藥后 6 h 內的尿液，并記錄尿液體積 ；第8天給藥1h后，按50mg/kg，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取腎臟，一份置于液氮罐中速凍后，置 -80℃冰箱保存 ；一份固定保存。檢測指標 ：尿量及腎臟 AQP1、AQP2、AQP4 mRNA 和蛋白表達。
Real-time PCR 檢 測 AQP1、AQP2 和 AQP4mRNA 的表達，按 Trizol 試劑說明提取細胞總 RNA，采用 MMLV逆轉率試劑盒操作說明逆轉錄 cDNA，在 95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 cycles 反應條件下進行熒光定量 PCR 反應。結果以 qrGAPDH 為內參，采用 2 -ΔΔCT SD 法進行結果分析，將各組 RQ 值（RQ = 2 -ΔΔCT SD）進行比較。
統(tǒng)計分析 ：使用 Gel-Pro32 軟件對結果進行灰度分析 ；實時熒光實驗結果采用 2 -ΔΔCT 的數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法。實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0 分析軟件進行分析，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，采用 LDS t-test 分析方法進行兩兩比較，P ＜ 0.05 認為有顯著差異，P ＜ 0.01認為有極顯著差異。
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