密度梯度離心技術分離穩定同位素的方法
導讀:有別于傳統的通過富集分離純化技術獲得一些純培養污染物降解功能微生物，穩定同位素技術（SIP-DNA）可以更加便捷的鑒定出功能基因。本研究上海安亭科學儀器廠針對 SIP-DNA 中密度梯
來源：未知
發布日期：2020-01-09 11:45【大 中 小】
據上海安亭科學儀器廠了解到超速離心機是分子生物實驗室最常用的科研儀器之一，能將具有不同沉降系數、質量和密度的混合物在離心機高速旋轉產生的離心力場作用下進行快速分離、濃縮和純化。密度梯度區帶離心法(簡稱區帶離心法)，是超速離心機常用的一種離心方法，在一定的離心力下將加入惰性梯度介質的樣品進行離心沉降，把所需的顆粒分配到梯度中某些特定位置，形成不同區帶的分離方法。該法能夠在保持顆粒活性條件下很好地將不同顆粒的物質進行分離。上海安亭科學儀器廠為探究環境中降解某種污染物功能微生物，傳統的方法是通過加大富集培養和分離的方式獲得。然而，并非所有微生物都可以獲得純培養，而且實驗室條件下獲得可培養的土壤微生物受到很多因素的限制。所以通過傳統方式獲得的某種污染物的功能降解菌可能無法準確反映污染環境中微生物分布的真實情況，也不能預測功能微生物對底物的同化代謝水平。
本研究上海安亭科學儀器廠就從這些問題出發，采用密度梯度離心法中的等密度區帶離心法，以貝克曼公司的OptimaXPN-100超速離心機，VTI-90垂直轉頭為例，用氯化銫為介質，構建了超速離心機分離SIP-DNA樣品的條件、相關參數，以及如何根據離心后樣品的指標判定樣品是否有效分離。目前該技術在國內只有少數幾個團隊使用，掌握該技術，可以為高?？蒲泻徒虒W提供強有力的技術手段，而且大大提高昂貴的超速離心機的使用價值。
FastDNA快速提取試劑盒（MoBioLaboratories,SolanaBeach,CA），CsCl（AR99%，成都西亞試劑），Tris-EDTA（TE，pH8.0）。OptimaXPN-100超速離心機，貝克曼垂直轉子VTI-90（最高轉速(rpm)90000，最大相對離心力(×g)645000，最大容量(ml)8×5.1），ND-1000UV-vis紫外可見分光光度計（NanoDropTechnologies，Wilmington，DE），AR200數顯手持式折光儀（LeicaMicrosystemsInc.）。
密度梯度離心技術是實現SIP-DNA樣品分離的關鍵技術，本研究上海安亭科學儀器廠通過實驗獲得了超速離心機分離SIP-DNA樣品的最佳條件（以CsCl為惰性介質，在20℃，45000g離心48小時，離心后分為14層）。根據每層的浮力密度和DNA濃度這兩個參數可以判定分離是否成功，成功分離后的重的同位素樣品與正常樣品相比不僅相同層數浮力密度大，在相同浮力密度層DNA濃度最大位置也會比較靠后。該技術可為后續16SrRNA高通量測序提供前提和保障。根據高通量數據結果可以從整體水平上反應環境樣品微生物群落水平，也可以更準確的認識自然條件下微生物的作用與具體的功能微生物。
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