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野生稻過氧化物酶分離純化

導(dǎo)讀:上海安亭科學(xué)儀器廠離心機(jī)在野生稻過氧化物酶分離純化的過程中的應(yīng)用，并檢測(cè)POD的酶學(xué)特性，從而進(jìn)一步研究野生稻抗逆生理尊定基礎(chǔ)。

來源：未知發(fā)布日期：2019-12-20 10:59【大中小】

上海安亭科學(xué)儀器廠離心機(jī)在野生稻過氧化物酶分離純化的過程中的應(yīng)用，并檢測(cè)POD的酶學(xué)特性，從而進(jìn)一步研究野生稻抗逆生理尊定基礎(chǔ)。

植物體內(nèi)含有多種POD同工酶，其同工酶譜和酶的活性在不同組織器官和不同生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)有較大變化，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物體內(nèi)存在不同POD同工酶，POD表達(dá)和活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。東鄉(xiāng)野生稻是迄今為止世界上自然分布最北的冬天能越冬的野生稻，能耐受-8.5℃的極端低溫，具有卓越的抗寒抗逆特性，是中國寶貴的野生稻種資源。筆者前期研究表明東鄉(xiāng)野生稻POD的活性在不同發(fā)育時(shí)期和環(huán)境脅迫下存在著差異。為深入研究東鄉(xiāng)野生稻過氧化物酶的功能和及其抗逆生理作用，本研究上海安亭科學(xué)儀器廠采用鹽析沉淀、柱層析方法和活性電泳對(duì)東鄉(xiāng)野生稻的過氧化物酶進(jìn)行純化和鑒定，并檢測(cè)POD的酶學(xué)特性，從而為進(jìn)一步研究東鄉(xiāng)野生稻抗逆生理奠定基礎(chǔ)。

1主要試驗(yàn)儀器
UV2600紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)（Himac，日本）；JA5003上皿電子天平（上海精科天平）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器）；多功能直射凝膠電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）；核酸蛋白檢測(cè)儀HD21C-B（上海康華生化儀器制造廠）；TH-500A梯度混合器（上海滬西分析儀器廠）；LM17型色譜記錄儀（永青示波器廠）

2.POD分離純化
（1）粗酶原液制備將所取水稻葉片用蒸餾水洗凈、濾紙拭干、稱重、剪碎后，置于預(yù)先冰浴冷卻的小研缽中，按照W/V=1:2比例加入酶提取液（40mmol/LpH6.0磷酸緩沖液）。冰浴研磨成勻漿后，4層紗布過濾，10000r/min離心20min，取上清液，上清液即為粗酶液，放入4℃冰箱中備用。

（2）粗酶原液的硫酸銨鹽析與透析采用硫酸銨(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法提取POD酶，粗酶液中緩緩加入硫酸銨使其達(dá)到20%的飽和度，同時(shí)輕輕攪拌，4℃條件下靜置一段時(shí)間后，10000r/min離心20min，收集沉淀，加入少量提取緩沖液溶解沉淀備用。重復(fù)上述步驟，繼續(xù)加入硫酸銨，使得樣品液中的硫酸銨飽和度依次達(dá)到40%、50%、60%、70%和80%時(shí)，分別收集沉淀，用等體積提取緩沖液溶解沉淀。各樣品液進(jìn)行透析脫鹽處理，測(cè)定蛋白含量和POD酶活力，計(jì)算比活力，從而確定沉淀提取POD酶的合適初始分級(jí)硫酸銨飽和度，然后依據(jù)合適的初始硫酸銨飽和度批量提取粗POD蛋白。

3討論與結(jié)論
綜上所述，本文上海安亭科學(xué)儀器廠以東鄉(xiāng)野生稻葉片組織為材料，通過浸提、硫酸銨鹽析、透析和SephadexG-100凝膠柱層析等系列步驟，分離得到POD1同工酶，其比活力為568.80U/mg，POD酶蛋白的純化倍數(shù)為16.49。聚丙烯凝膠活性電泳檢測(cè)表明，純化得到了單一組分的東鄉(xiāng)野生稻POD酶蛋白。經(jīng)測(cè)定，POD酶Km為1.26mmol/(L·min)，最大反應(yīng)速度Vmax為17.51mmol/(L·min)，最適宜的pH5.0，最適宜溫度35℃~45℃，Cu2+和Zn2+對(duì)POD有較強(qiáng)的激活作用，而Fe3+對(duì)POD活性有一定的抑制作用，POD酶活性受甲醇、乙醇和丙酮等有機(jī)試劑抑制。研究表明，過氧化物酶與植物生長(zhǎng)密切相關(guān)，過氧化物酶是植物體內(nèi)活性氧酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，在生物脅迫和非生物脅迫條件下均發(fā)揮作用，前期工作也發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻體內(nèi)過氧化物酶的活性隨著生育期不同而發(fā)生變化，本研究進(jìn)一步純化了東鄉(xiāng)野生稻POD酶并研究了酶的催化特性，為深入探討其在體內(nèi)生理功能奠定了基礎(chǔ)。

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野生稻過氧化物酶分離純化

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